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上次我们分享了：全基因组DNA甲基化实验怎么做：手把手教你做全基因组DNA甲基化测序分析，深受同学们的欢迎。
本期，易基因小编给您讲讲简化基因组DNA甲基化实验怎么做，从技术原理、建库测序流程、信息分析流程等三方面详细介绍。
简化基因组甲基化测序原理示意图如下：
图1：RRBS工作流程
对DNA样品的检测主要包括2种方法：
（1）Qubit对DNA浓度进行精确定量；
（2）琼脂糖凝胶电泳分析DNA降解程度以及是否有污染；
（1）基因组 DNA 提取：根据不同的样品类型采用不同的提取方案，获取高质量的基因组 DNA。
（2）DNA 质量检测：Qubit 检测 DNA 样品浓度，琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 样品完整性。
（3）限制性酶切：通过酶切富集 CpG 片段。
（4）末端修复，加 A，甲基化接头连接：在 DNA 分子两端引入接头序列及 index 序列。
（5）选择 CpG 富集的 DNA 片段：电泳回收选择富含 CpG 的 250-500 bp 片段。
（6）Bisulfite 转化：回收的基因组 DNA，加入 lamda DNA（一种噬菌体 DNA，用于监测重亚硫酸盐测序的转化效率），随后通过 Bisulfite 处理将非甲基化碱基 C 转化成 U。
（7）PCR ：PCR 扩增富集文库及纯化PCR产物获得最终文库。
文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/μl，随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，使用qPCR方法对文库的有效浓度进行准确定量（文库有效浓度> 2nM），以保证文库质量。
文库检测合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后在illumina Nova平台测序，测序策略为PE150。
将测序结果与参考基因组比对，比对上唯一位置的序列用于后续标准信息分析及个性化分 析。信息分析流程如下：
图2：RRBS信息分析流程示意图
1、数据产出与质控
测序完成后，对数据进行去除接头序列和低质量过滤，随后将过滤后的数据与参考基因组比对。数据过滤标准为：包含adapter 序列，序列中N 碱基的比例超过序列总长度的5%，序列中质量值小于 5 的碱基比例超过序列总长度的 50%，如果一条序列符合以上三个条件中的任何一个，则去除这条序列。
2、C 碱基有效测序深度的累积分布和覆盖度
以下图为示例，反映了 CpG，CHG 和 CHH 碱基有效测序深度的累积分布（基于有效数据计算）。其中横轴表示碱基有效测序深度，纵轴表示一定测序深度下碱基的覆盖度（占基因组总位点的比率）。
图3：CpG，CHG 和 CHH 碱基累积深度和覆盖度
1、全基因组甲基化水平
每一个甲基化 C 碱基的甲基化水平均按如下公式进行计算：C 位点的甲基化水平 = 100 * 支持甲基化的 reads / (支持甲基化的 reads + 支持非甲基化的 reads)。全基因组平均甲基化水平反应了基因组甲基化图谱的总体特征。以下图为示例，反映了样本的整体甲基化率分布， X 轴表示不同的甲基化率范围，Y 轴表示不同甲基化率范围内 C 位点数目的百分比。可以看出低甲基化C 位点比例较高。后续分析均采用 5X 以上 C 位点。
图4：C位点在不同甲基化率范围的百分比
2、全基因组C碱基的平均甲基化水平
不同分布类型的甲基化C 位点（mC）在不同物种基因组中出现比例不同，因此，各类型甲基化C 位点( mCG、mCHG 和 mCHH ) 的数目，及其在全部 mC 的位点中所占的比例 ( 例：mCHG 所占比例= mCHG 数目/mC 的总数 )，在一定程度上反映了特定物种的全基因组DNA 甲基化修饰特征。
图5：全基因组C 位点平均甲基化水平
3、全基因组三种类型甲基化位点的比例分布
计算全基因组中 CG, CHG 和 CHH 三种类型的甲基化位点的数量和比例。
图6：CG, CHG 和 CHH 三种类型的甲基化位点的数量和比例
4、染色体水平的甲基化和C碱基密度分布
从染色体水平来描述甲基化 C 碱基的的分布情况（仅>50M 的序列）。绿色细线表示以 10kb 的窗口统计甲基化 C 碱基的密度在染色体上的分布情况，光滑曲线则表示不同类型甲基化C 碱基( CG、CHG 和 CHH )的密度分布。
以下图为示例：
图7：染色体上甲基化 C 密度分布示例
说明：X 轴表示某染色体上碱基的位置，左Y 轴表示特定染色体碱基位置上 10kb 窗口内不同类型甲基化C 占该类型所有C 的比例（分为 CG、CHG、CHH，H 代表A 或者T），右 Y 轴表示特定染色体碱基位置上 10kb 窗口内甲基化C 的碱基密度（甲基化 C 数目占总碱基数目的比例）。为了区别CHH 与 CHG 曲线，已将 CHH 甲基化水平×50 倍放大绘出。
5、甲基化 C 位点附近的9bp序列的序列特征分析
分析CG和非CG位点的甲基化的C附近碱基的分布情况，统计不同甲基化模式出现的概率。下图为示例：
图8：CG 位点的甲基化C附近序列特征示例
说明：X 轴表示甲基化 C 碱基（CG、CHG 和 CHH）上下游4bp的位置，Y轴表示特定位置上A、T、C、G 四种碱基的权重值，权重值越高表示其比例越高。
6、分析CpG island 及其周边区域的甲基化水平分布规律
以下图为示例，反映了样本在 CpG island，CpG island shore（CpG island上下游2kb区域）和 CpG island shelf（CpG island 上下游 2000pb 至 4000bp）区域的甲基化水平分布情况。可以看出 CpG island 区域的甲基化水平整体较低，而 CpG island shore 的甲基化水平分布较均匀，更远离CpG island的CpG island shelf甲基化水平最高。
图9：CpG island 及其周边区域的甲基化水平分布
1、CpG 甲基化相关性分析（PCC）
下图示例反映了样本之间 CpG 甲基化率的相关性，圆面积越大，颜色越深相关性越高。
图10：CpG 甲基化相关性分析（PCC）
2、CpG 甲基化主成分分析（PCA）
主成分析（PCA）是一种常用的数据降维方法，其目标是寻找一组新的变量，使它们反映原始数据的主要特征。每个新变量是原有变量的线性组合，称为“主成分”。这组新变量中，只有少数几组变量能够反映原有变量的主要特征，通过这种方式，可以使原有数据的维度降低，更易于体现各样本的特征。下图为基于样本甲基化图谱的主成分析：
图11：不同时间点样本间CpG甲基化水平的PCA分析
3、CpG 甲基化聚类分析（Clustering）
根据全基因组甲基化图谱及羟甲基化图谱，对样本进行聚类，可从总体水平反应样本组内和组间差异。聚类采用层次聚类方法（Hierachial Custering），其基本算法如下：
（1） 把每个样本归为一类，计算每两个类之间的距离，即样本与样本之间的相似度；
（2） 按一定规则选取符合距离要求的类别，并作类间合并；
（3） 重新计算新生成的类与各个旧类之间的相似度；
（4） 重复 2 和 3 直到所有样本点都归为一类。
根据样本间欧几里得距离，利用R语言hclust函数对样本做聚类，聚类方法选择ward.D2，即最小方差法，其基本思想为：每次类间合并则总离差平方和都要增加，ward.D2方法选择使离差平方和增加最小的两类进行合并。
1、差异甲基化区域（DMR）检测
DMR检测使用权威期刊发表的metilene 软件，该软件利用二元分隔算法（binary segmentation algorithm）结合双重统计学检验（MWU-test和2D KS-test），可快速实现成对样本或两组样品间的DMR 重头检测(de novo)。最后，通过多重检验校正，进而得到差异甲基化区域。使用CpG 位点来寻找差异甲基化区域。
DMR 检测规则：
① 每个CpG 位点测序深度>=5x;
② CpG 位点的甲基化差异>=0.2;
③ 该区域的差异甲基化 CpG 位点个数>=5;
④ 相邻差异甲基化CpG 位点的距离<=300bp;
⑤ MWU-test p-value < 0.05。
2、差异甲基化区域（DMR）的注释
将 DMR 分别注释到genebody和 promoter 区。
表1：DMR 注释结果（部分）
3、差异性甲基化基因（DMG）的功能分析
将有至少一个 DMR 注释到其 promoter 或 genebody 的基因称之为差异甲基化基因。 有研究表明 promoter 区域甲基化提高具有潜在抑制基因转录的功能；而 genebody 区域 与表达具有正相关关系。所以研究这两个区域发生差异甲基化的基因，可以帮助我们研 究受甲基化调控的细胞功能的变化规律。
GO、KEGG 富集分析。为了研究DMG的功能，采用超几何分布检验（Hypergeometric distribution test）分析 DMG在GO term和KEGG pathway中的富集情况。
4、差异性甲基化区域（DMR）的可视化
由于DMR 数量太多，筛选 Q-value top20 的差异甲基化区域进行可视化绘图。下图为例，黄色部分为 DMR 区域。横坐标以绘出以 DMR 区域为中心向两侧各扩展 1kb 区域的甲基化情况。最上方黑色方框标识出该区域内基因 promoter 区的位置（如果有）和基因表达方向。中间部分是两组样本的甲基化水平变化曲线。最下方是 CG 位点密度曲线。
图12： 组间 DMR 差异甲基化曲线
RRBS揭示肠道对早产的快速适应涉及喂养相关的猪肠道基因DNA甲基化重编程
Gao F,et al. Rapid Gut Adaptation to Preterm Birth Involves Feeding-Related DNA Methylation Reprogramming of Intestinal Genes in Pigs. Front Immunol. 2020;11:565.
研究摘要：
早产后，未成熟的肠道功能和免疫功能必须迅速适应细菌定植和肠内喂养。作者为验证肠道表观遗传变化与早产及首次喂养时的肠道反应有关，以仔猪为模型，对早产猪和足月猪进行全肠外营养（TPN）或部分肠内喂养5天，然后用牛奶进行纯肠内喂养，直到第26天（断奶年龄）。比较分析早产猪和足月猪在第0天、第5天和第26天的肠道结构、功能、微生物组、DNA甲基组和基因表达（每组n=8）。RRBS结果显示，出生时早产猪肠道出现绒毛萎缩和整体高甲基化，影响与Wnt信号通路相关的基因。在生命的前5天，高甲基化相关的LBP（lipopolysaccharide binding protein）和TLR4（Toll-like receptor 4）通路基因表达明显降低，但大多数早期甲基化差异在第26天消失。直到第26天，早产猪的蔗糖酶和麦芽糖酶活性仍然降低，肠道微生物群发生改变。0-5天期间显示许多新的甲基化差异，主要表现在未提供肠内喂养（TPN喂养）的情况下。这些甲基化差异影响了与细胞代谢相关的肠道基因，包括通过启动子低甲基化增加GCK（葡萄糖激酶）表达。总之，未成熟肠道在早产后可迅速适应其基因甲基化和表达的能力，只有少数早产相关缺陷会持续到断奶。结果表明早期肠内喂养对于刺激肠道基因的甲基化重编程可能很重要，从而使肠道快速适应早产环境。
早产猪和足月猪肠道的甲基化差异
参考文献：
[1] Yuanxin Xi et al. BSMAP: whole genome bisulfite sequence MAPping program. BMC Bioinformatics, 2009, 10:232.
[2] Frank Jühling et al. metilene: Fast and sensitive calling of differentially methylated regions from bisulfite sequencing data. Genome Research, 2016, 26: 256-262.
[3] Gao F,et al. Rapid Gut Adaptation to Preterm Birth Involves Feeding-Related DNA Methylation Reprogramming of Intestinal Genes in Pigs. Front Immunol. 2020;11:565.
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