2024年01月13日，华南农业大学林业与园林学院张庆教授团队在《Chemical Engineering Journal》杂志上发表了以《Novel strategy to understand the aerobic deterioration of corn silage and the influence of Neolamarckia cadamba essential oil by multi-omics analysis》为题的研究论文，该研究通过多组学分析方法，深入探讨了青贮饲料的好氧变质过程，并提出了一种新的策略来改善青贮的有氧稳定性，这对于动物生产和环境保护具有重要意义。
标题：Novel strategy to understand the aerobic deterioration of corn silage and the influence of Neolamarckia cadamba essential oil by multi-omics analysis（利用多组学分析了解玉米青贮好氧变质及黄梁木叶精油对其影响的研究）
时间：2024-01-13
期刊：Chemical Engineering Journal
影响因子：15.1
研究背景：青贮饲料（silage）是一种厌氧发酵饲料，容易受到不良微生物活动的影响而发生有氧恶化。这种恶化会导致重要营养成分的减少，影响动物生产性能和食品安全。为了更好地理解青贮饲料的有氧恶化过程及其潜在机制，以及黄梁木Neolamarckia cadamba（NCL）精油对这一过程的影响，研究者进行了宏基因组学、转录组学和代谢组学的分析。
实验方法：研究者在2021年制备了全株玉米青贮，并在暴露于空气中的不同时间点（0、3、7、14天）进行了温度、发酵质量、微生物群落和代谢物的分析。随后，提取并分析了NCL精油的成分，并研究了其对从有氧恶化青贮中分离出的微生物菌株的抗菌活性。最后，在2022年，将NCL精油添加到全株玉米青贮中，研究其对青贮有氧稳定性的影响和机制。
研究结果：
玉米青贮的有氧恶化：全株玉米青贮在有氧条件下出现恶化，包括温度上升、pH值变化、酵母和霉菌计数的增加，以及乳酸和乙酸含量的减少。同时通过主坐标分析（PCoA），观察到微生物群落结构发生变化。在有氧恶化过程中，特定的细菌和真菌群落（如Bacillales、Clostridiales、Saccharomycetales和Eurotiales）的相对丰度增加，这些可能是导致青贮有氧恶化的原因（图1，表1）。其中微生物群落动态与化学成分的变化有关，同时与青贮的营养价值和稳定性密切相关（图2）。
图1. 全株玉米青贮在空气中暴露14 d的变化。
图1A展示了全株玉米青贮在14天暴露于空气后发霉的过程。
图1B展示了pH值和酵母计数随时间的变化，这些变化与微生物群落的活动和青贮的有氧恶化过程相关。
图1C-D通过主坐标分析（PCoA）展示了细菌和真菌群落结构在不同时间点的变化。
图1E-F反映了细菌和真菌的动态变化。
图2 全株玉米青贮在空气中暴露14 d的代谢组
图2A展示了代谢物的聚类分析，颜色表示每个代谢物的积累水平，从低（绿色）到高（红色）。
图2B展示了代谢物的主成分分析，显示了不同时间点样本之间的差异。
图2C展示了代谢物的K-means聚类分析，颜色表示代谢物在14天暴露期间的趋势（绿色表示增加，红色表示减少）。
图2D展示了通过KEGG数据库注释的代谢物在不同代谢途径中的分布，以及与青贮暴露前后的比较。
NCL精油的抗菌活性：NCL精油对从有氧恶化青贮中分离出的菌株（包括Candida glabrata和Niallia circulans）表现出强抗菌能力，其最低抑菌浓度（MIC）在0.624到10 μg/mL之间。通过转录组学分析，研究了NCL精油处理后Candida glabrata和Niallia circulans的基因表达变化。结果显示，NCL精油可能通过影响这些菌株的能量和物质代谢途径来抑制其生长（图3）。
图3. NCL精油对变质玉米青贮微生物菌种的影响。
图3A展示了微生物群落与代谢物之间的相关性分析，揭示了微生物群落对代谢物的影响。
图3B展示了NCL精油对分离菌株的最小抑菌浓度（MIC）。
图3C-D展示了Niallia circulans和Candida glabrata在NCL精油处理前后的差异表达基因的火山图。红色和绿色点分别代表上调和下调的差异表达基因。
图3E-F展示了Niallia circulans和Candida glabrata在NCL精油处理后，与KEGG途径相关的基因表达变化。
NCL精油对青贮有氧稳定性的影响：添加NCL精油可以提高全株玉米青贮的有氧稳定性，通过防止酸度下降、温度和pH值上升、酵母和霉菌计数增加，维持乳酸和乙酸含量（图4，表2），以及降低Lysinibacillus、Bacillus、Paenibacillus、Clostridium、Aspergillus等菌属的相对丰度，从而抑制了有氧恶化过程中的微生物活动（图5）。通过转录组学和代谢组学分析，研究还发现，NCL精油如何通过下调与代谢途径相关的基因表达来抑制微生物的生长和代谢活动。
图4. NCL精油对空气暴露后玉米青贮的影响。
图4展示了NCL精油对全株玉米青贮在7天有氧暴露期间温度变化的影响，以及对pH值、酵母和霉菌计数的影响。结果显示，NCL精油的添加减缓了温度上升，降低了pH值，并减少了酵母和霉菌的计数。
图5. 全株玉米青贮暴露于空气7天后微生物群落的相对丰度。
图5表明NCL精油处理显著改变了微生物群落的结构，特别是在属水平上的变化。
图6. NCL精油处理后的玉米青贮在空气中暴露7天后差异表达基因和差异积累代谢物的情况。
图6揭示了NCL精油如何通过影响特定的代谢途径，特别是氨基酸代谢，来抑制微生物的生长和代谢活动。
研究结论
NCL精油通过抑制代谢活动，特别是Saccharomycetales和Bacillales等促进有氧恶化微生物的氨基酸代谢，改善了全株玉米青贮的有氧稳定性。这项研究为控制有氧恶化提供了新的视角和目标，并为高质量青贮生产提供了理论基础。研究建立的微生物群落和菌株分析策略可能对生物质、饲料、食品等的发酵研究提供可能性。
关于易基因宏基因组学测序研究方案
由于扩增子测序技术关注的是目标基因的若干区域，因此其分辨率有限，一般认为较为准确的分类水平到属级别。虽然扩增子测序也可以通过数据库映射预测群落可能的功能网络，但是微生物遗传片段交流比较频繁，功能基因的横向转移也较为普遍，依托于有限菌株建立的功能映射无法尽可能的还原群落的真实功能网络。全宏基因组测序技术直接对提取的全宏基因组DNA建立随机小片段文库，能够获取更多的序列信息。通过组装、ORFs预测与注释，可以大大提高分类水平部分至菌株级别，并通过各种大型公共数据库进行相应功能注释，尽可能真实的获取群落功能网络信息。高精度的分析结果也使相关动物验证实验更加具备可行性。
技术优势：
1) 超深度视野： 提取的全宏基因组DNA建立随机小片段文库，避免了目的片段的PCR过程，降低bias，随机测序，获取更丰富的序列信息；
2) 更精确分类定位： 最大限度地获取全宏基因组序列信息，通过组装延伸，可精确定位部分序列至分类学菌株水平；
3) 真实可靠的功能分析： 不再是依托映射数据库进行功能预测，而是通过测得的功能基因序列尽可能真实还原构建微生态系统的功能网络。
实验策略：
分析流程：
样本及周期：
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参考文献：
Shuo, Wu & Peishan, Huang & Chao, Zhang & Wei, Zhou & Xiaoyang, Chen & Qing, Zhang. (2024). Novel strategy to understand the aerobic deterioration of corn silage and the influence of Neolamarckia cadamba essential oil by multi-omics analysis. Chemical Engineering Journal. 482. 148715. 10.1016/j.cej.2024.148715.
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