人类呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）是引起婴幼儿和老年人呼吸道感染的常见病原体，目前尚无特效药物。N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物mRNA上最常见的修饰之一，参与多种细胞过程和病理过程的调控，包括病毒感染。研究表明，m6A修饰在病毒感染过程中发生变化，可能影响宿主的抗病毒免疫反应。

 

近日，遵义市第一人民医院（遵义医科大学第三附属医院）呼吸内科李竹博士等为第一作者，贵州省人民医院刘代顺教授为通讯作者，在《iScience》杂志发表题为《The GDF6-FTO axis modulates the innate immune and inflammatory response to human respiratory syncytial virus》的研究论文，探讨了m6A修饰在人类呼吸道合胞病毒（RSV）感染中的作用，特别是FTO（脂肪质量和肥胖相关蛋白）和GDF6（生长分化因子6）在调控宿主抗病毒免疫和炎症反应中的功能。研究发现，RSV感染导致宿主m6A修饰水平下降，FTO表达增加，而FTO通过调控GDF6的m6A修饰影响病毒复制和免疫反应。研究结果为开发靶向RSV感染的新疗法提供了潜在的分子靶点。易基因为本研究提供所需的m6A MeRIP-seq测序分析技术服务。

标题：The GDF6-FTO axis modulates the innate immune and inflammatory response to human respiratory syncytial virus（GDF6-FTO轴调控对人类呼吸道合胞病毒的先天免疫和炎症反应）

发表时间：2024年10月18日

发表期刊：iScience

影响因子：IF5.8

技术平台：MeRIP-seq、RNA-seq（易基因金牌技术）

研究亮点

l  RSV感染促进去甲基化酶FTO增加：RSV感染导致去甲基化酶FTO的表达水平上升。

l  FTO耗竭稳定了GDF6的mRNA：在FTO基因敲除的细胞中，GDF6的mRNA稳定性增强。

l  结合蛋白IGF2BP1缺失导致GDF6表达下降：IGF2BP1（胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1）的缺乏会降低GDF6的表达水平。

l  FTO/GDF6轴改变I型干扰素和促炎因子：FTO和GDF6互作可调控I型干扰素和促炎细胞因子水平。

 

研究摘要

本研究通过MeRIP-seq和对应的RNA-seq分析，揭示了去甲基化酶FTO（脂肪质量和肥胖相关蛋白）耗竭能够稳定GDF6的mRNA，增强I型干扰素（I-IFN）水平，并降低促炎因子的表达，从而发挥抗病毒效应。此外结合蛋白IGF2BP1缺失会导致GDF6表达下降，进而减少I型干扰素产生。并进一步证实了RSV感染患者咽拭子样本中m6A水平的变化。总之，本研究结果表明，RSV感染能够诱导宿主m6A修饰水平变化，而FTO介导的m6A修饰通过促进GDF6 mRNA的稳定性和蛋白翻译，确保了抗病毒免疫反应进行。

FTO-GDF6轴、m6A修饰、抗病毒免疫和病毒复制之间关系机制图形摘要

 

 

研究方法

细胞实验：使用BEAS-2B（人支气管上皮细胞）进行RSV感染实验。

临床样本分析：收集RSV感染儿童的咽拭子样本，检测m6A修饰水平。

基因敲除和过表达：通过慢病毒载体构建FTO敲除和GDF6过表达的细胞模型。

m6A检测：使用m6A比色法、质谱（MS）分析、RNA斑点印迹等方法检测m6A修饰水平。

转录组测序（RNA-seq）和m6A免疫沉淀测序（MeRIP-seq）：分析RSV感染后m6A修饰的基因变化。

Western Blot：检测蛋白质表达水平。

小鼠模型：通过小鼠模型验证RSV感染的病理变化和FTO、GDF6的功能及qPCR验证。

 

结果图形

（1）RSV感染与低水平m6A mRNA甲基化相关

RSV感染后，BEAS-2B细胞和儿童咽拭子样本中的m6A修饰水平显著下降，且这种下降与FTO表达增加相关。这表明FTO可能在RSV感染过程中起主要作用。

图1：RSV感染期间m6A表达下调，与FTO水平升高一致。

(A) m6A比色法检测BEAS-2B细胞在RSV感染24h后的mRNA m6A修饰整体水平。

(B) m6A比色法检测BEAS-2B细胞在400TCID50/mL RSV感染后不同时间点的m6A水平。

(C) LC-MS量分析BEAS-2B细胞在400TCID50/mL RSV感染24h后的m6A丰度。

(D) m6A比色法定量分析咽拭子样本中总RNA的m6A含量（每组n=16）。

(E) RSV感染24h后BEAS-2B细胞RNA水平的斑点印迹分析。

(F) qPCR分析BEAS-2B细胞在RSV感染24h后的m6A调控因子表达。

(G) GSE3397数据集的m6A调控因子热图。

(H-J) Western blot分析BEAS-2B细胞在RSV感染后RSV-F和FTO的蛋白表达。

(K) qPCR分析咽拭子样本中FTO的表达。

(L) m6A修饰与FTO表达之间的相关性分析。

 

（2）RSV感染抑制细胞增殖，激活先天免疫，并促进炎症细胞因子释放

RSV感染抑制了BEAS-2B细胞的增殖，并显著增加了炎症细胞因子（如IL-1、IL-6）和I型干扰素（IFN-α、IFN-β）的表达，激活了宿主的先天免疫反应。

图2：RSV感染抑制细胞增殖，激活先天免疫，并促进炎症细胞因子释放

(A) 在RSV感染后不同时间点，TCID50法检测HEp-2细胞中的RSV病毒滴度。

(B) 在RSV感染后不同时间点，CCK-8实验分析BEAS-2B细胞的增殖情况。

(C-H) RSV感染24小时后BEAS-2B细胞的qPCR分析。

(I-O) RSV感染24小时后BEAS-2B细胞中RSV-G、TLR7、MyD88、RIG-I和IL-6蛋白水平的Western blot分析。

 

（3）体外实验中FTO对抗病毒免疫是必需的

FTO基因敲除的BEAS-2B细胞中，I型干扰素和抗病毒基因的表达显著增加，而炎症细胞因子的表达减少，表明FTO在调节抗病毒免疫中起关键作用。

图3：体外实验中FTO对抗病毒免疫是必需的。

(A) 使用慢病毒载体建立FTO基因敲除的稳定细胞系。

(B-C) 对照组和FTO基因敲除BEAS-2B细胞的RNA-seq结果进行GO和KEGG分析。

(D) FTO基因敲除组TNF信号通路和炎症反应转录特征的双尾基因集富集分析。

(F) 炎症细胞因子和干扰素相关基因的表达变化倍数。

(G–L) 在RSV感染24h后，对照组和FTO基因敲除的BEAS-2B细胞的qPCR分析。

 

（4）FTO调节病毒复制和炎症反应

FTO基因敲除的细胞中，RSV复制减少，I型干扰素和炎症细胞因子表达变化，表明FTO对RSV复制和炎症反应有重要作用。

图4：FTO调控病毒复制和炎症反应

(A) m6A比色法分析FTO基因敲除细胞中mRNA m6A修饰的总体水平。

(B) CCK-8实验分析RSV感染期间不同时间点FTO基因敲除细胞的细胞增殖情况。

(C) TCID50法检测400 TCID50 RSV感染后FTO基因敲除细胞中RSV的病毒滴度。

(D-E) 在RSV感染24h后，对照组和FTO基因敲除的BEAS-2B细胞的qPCR分析。

(F) 在RSV感染24h后，FTO基因敲除BEAS-2B细胞中RSV-G和RSV-F蛋白水平的Western blot分析。

(G–J) 在RSV感染24h后，对照组和FTO过表达的BEAS-2B细胞的qPCR分析。

 

（5）GDF6是FTO的直接靶标

通过MeRIP-seq和RNA-seq分析，发现GDF6是FTO的潜在靶基因，FTO通过m6A修饰调节GDF6的mRNA稳定性和蛋白表达。

图5：通过MeRIP-seq和RNA-seq鉴定FTO靶标。

(A) 在RSV感染的BEAS-2B细胞中，MeRIP-seq检测到主要的共有序列“RRACH”。

(B) m6A peaks在mRNA转录本上的密度分布。

(C) 与对照组相比，KEGG富集分析与RSV感染的BEAS-2B细胞中的m6A修饰相关。

(D) RNA-seq鉴定出在有或没有FTO基因敲除的BEAS-2B细胞中上调或下调的基因。

(E-F) 筛选出在MeRIP-seq中下调且在RNA-seq中上调的共有基因。

(G) 在RSV感染或未感染的BEAS-2B细胞中进行24小时qPCR分析。

(H) 在有或没有FTO基因敲除的RSV感染BEAS-2B细胞中进行qPCR分析。

(I) 在咽拭子样本中对GDF6进行实时定量PCR（qPCR）分析。

(J-K) 在有或没有FTO基因敲除的RSV感染BEAS-2B细胞中对GDF6进行西方印迹（Western blot）分析。

 

参考文献：

Li Z, Zhang L, Liu Y, Li H, Gong L, Tan X, Tian J, Pi H, Wang B, Zhao Y, Liu D. The GDF6-FTO axis modulates the innate immune and inflammatory response to human respiratory syncytial virus. iScience. 2024 Oct 18;27(10):111038.doi: 10.1016/j.isci.2024.111038.