近日，浙江大学医学院附属第一医院血液科叶文乐博士为第一作者，金洁教授、孙杰研究员为共同通讯作者，在肿瘤学领域国际顶刊《Molecular Cancer》发表题为《NSUN2-mediated cytosine-5 methylation of FSP1 protects acute myeloid leukemia cells from ferroptosis》的研究论文，研究揭示了NSUN2（NOP2/Sun RNA methyltransferase 2）介导的RNA胞嘧啶-5甲基化（m5C）修饰在急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）中的重要作用。研究发现，NSUN2在AML患者样本中异常高表达，并与不良预后相关。NSUN2通过催化FSP1（ferroptosis suppressor protein 1）mRNA 3’UTR的m5C修饰，促进其被YBX1（Y-box binding protein 1）识别和稳定，从而维持FSP1蛋白水平，保护AML细胞免受铁死亡（ferroptosis）。此外，NSUN2抑制剂MY-1B和FSP1抑制剂iFSP1展现出抗白血病活性，并与铁死亡诱导剂及标准AML治疗药物产生协同作用，为AML治疗提供了新的潜在靶点和联合治疗策略。深圳易基因提供的RNA-Bis-seq技术服务助力研究团队揭示NSUN2-FSP1轴在急性髓系白血病铁死亡中的关键表观调控机制。
标题：NSUN2-mediated cytosine-5 methylation of FSP1 protects acute myeloid leukemia cells from ferroptosis（NSUN2介导FSP1 m5C甲基化保护急性髓系白血病细胞免受铁死亡）
发表时间：2025年7月21日
发表期刊：Molecular Cancer
影响因子：IF33.9/Q1
技术平台：RNA-Bis-seq（RNA-BS）、RNA-seq等（易基因金牌技术）
作者单位：浙江大学医学院附属第一医院血液科金洁、孙杰、叶文乐等
DOI：10.1186/s12943-025-02394-8
RNA m5C是一种普遍存在的表观转录组修饰，对基因表达和细胞稳态起着关键调控作用。尽管其在实体瘤中的作用逐渐被认识，但m5C在急性髓系白血病（AML）中的功能图谱仍然未知。本研究通过RNA-Bis-seq等实验揭示NSUN2（主要的RNA m5C甲基转移酶）是AML进展的关键调控因子。NSUN2在AML患者样本中异常高表达，并与不良预后相关。功能研究表明，NSUN2促进白血病细胞增殖，在异种移植模型中增强肿瘤生长，并赋予细胞对铁死亡的抵抗力。从机制上讲，NSUN2催化FSP1 mRNA 3’UTR的m5C修饰沉积，促进其被m5C reader蛋白YBX1识别和稳定。这一NSUN2-YBX1-FSP1轴通过抑制脂质过氧化和氧化损伤，保护AML细胞免受铁死亡应激。NSUN2或FSP1缺失诱导线粒体重塑，使细胞易于发生铁死亡。野生型NSUN2或FSP1重构建挽救铁死亡抗性，而催化失活的NSUN2（C271A/C321A）或功能缺失的FSP1突变体（G2A/E156A）未能转换这一表型。通过NSUN2抑制剂MY-1B或FSP1抑制剂iFSP1进行药理学抑制表现出强大的抗白血病效应，并与铁死亡诱导剂、标准化疗和BCL-2抑制剂维奈托克（venetoclax）产生强大的协同作用。本研究揭示了NSUN2和FSP1作为AML的预后生物标志物和治疗靶点。强调了将RNA甲基化与铁死亡逃避联系起来这一新的表观转录组机制，为克服AML治疗耐药性提供了一种双重策略方法。
研究方法
患者样本收集：收集303例AML患者的骨髓和外周血样本，用于分析NSUN2和FSP1的表达水平及其与预后的关系。
细胞培养与处理：使用多种AML细胞系（如MOLM-13、THP-1等）进行实验，包括基因敲除、过表达和药物处理等。
RNA-Bis-seq+RNA-seq：分析NSUN2缺失对AML细胞中RNA m5C修饰的影响，鉴定NSUN2介导的m5C修饰位点；对RNA-Bis-seq和转录组数据关联分析，筛选与NSUN2介导的m5C修饰相关的差异表达基因。
基因编辑技术：通过CRISPR-Cas9基因编辑技术构建NSUN2基因敲除细胞模型，以及通过慢病毒介导的过表达系统构建NSUN2和FSP1过表达细胞模型。
细胞功能实验：包括细胞增殖实验、克隆形成实验、流式细胞术分析细胞周期和铁死亡水平等，评估NSUN2和FSP1对AML细胞功能的影响。
动物模型实验：构建NSUN2基因敲除或FSP1基因敲除的AML小鼠模型，观察其对AML进展的影响。
药物联合实验：分析NSUN2抑制剂MY-1B与铁死亡诱导剂RSL3以及标准AML治疗药物（如阿糖胞苷）的联合治疗效果。
结果图形
（1）NSUN2促进急性髓系白血病进展并预测不良预后
研究人员分析了NSUN2在AML患者样本中的表达水平，发现其在AML患者中显著高于健康供体（图1a、b），且与不良预后相关（图1c、d）。在体外实验中，NSUN2基因敲除的AML细胞增殖能力下降（图1h、i），克隆形成能力减弱。在体内实验中，NSUN2基因敲除的AML细胞在小鼠模型中形成的白血病负荷减少，生存期延长（图1l-n）。
图1：NSUN2促进急性髓系白血病进展并预测不良预后。
（a）GSE30029数据集中，46名AML患者与31名健康供体的CD34+骨髓（BM）细胞中NSUN2 mRNA水平。
（b）与24名健康对照相比，303名新诊断AML患者的骨髓细胞中NSUN2 mRNA表达水平。
（c）GSE12417数据集中，根据NSUN2中位数表达水平分层的AML患者的Kaplan-Meier生存分析。
（d）根据NSUN2表达水平分层的AML患者总生存Kaplan-Meier曲线（中位数截断：NSUN2低表达，n=151；NSUN2高表达，n=152）。
（e）健康供体（N1-N3）和AML患者（P1-P6）原代骨髓样本NSUN2蛋白水平的Western blot分析。
（f）MOLM-13和THP-1细胞用对照shRNA（shCtrl）或两种独立的NSUN2靶向shRNA（shNSUN2#1/#2）转导后的NSUN2敲低效率RT-qPCR验证。n=3。
（g）MOLM-13和THP-1细胞中NSUN2敲低后Western blot分析。
（h-i）通过CellTiter-Glo实验分析NSUN2敲低的MOLM-13（h）和THP-1（i）细胞的细胞活性，持续5天（n=3）。
（j-k）用EdU掺入实验定量检测NSUN2敲低的MOLM-13（j）和THP-1（k）细胞中的增殖细胞的流式细胞术分析。
（l）通过生物发光成像监测B-NDG小鼠体内白血病负荷，这些小鼠移植了经shCtrl或shNSUN2转导的MOLM-13-luc细胞。从7-42天，每周进行一次生物发光成像。
（m）对（l）中小鼠的生物发光信号强度（光子/秒）进行定量分析。
（n）比较移植了shCtrl和shNSUN2转导的MOLM-13细胞的小鼠的Kaplan-Meier生存曲线。n=6。
（o）shCtrl或shNSUN2小鼠组的股骨的HE染色代表性图像。
（p）通过流式细胞术分析骨髓（BM）和脾脏中hCD45+白血病母细胞的比例（n = 3）。
（q）在第21天被处死的小鼠的脾脏重量（n=3）。
（2）NSUN2缺失介导AML细胞对铁死亡敏感
RNA-seq测序分析显示，NSUN2缺失的AML细胞中细胞周期相关通路被抑制（图2a），而铁死亡相关通路被激活（图2d、e）。尽管在基础条件下，NSUN2缺失细胞并未表现出自发的脂质过氧化，但透射电子显微镜（TEM）观察到其线粒体出现铁死亡特征性的形态变化（图2f）。在铁死亡诱导剂（如RSL3和Erastin）处理下，NSUN2缺失的AML细胞表现出更高的铁死亡敏感性（图2g-j），表现为更低的半抑制。
图2：NSUN2缺失介导AML细胞对铁死亡敏感。
（a）基因集富集分析（GSEA）显示，在NSUN2敲低的MOLM-13细胞中，细胞周期通路被上调。
（b）通过流式细胞术分析MOLM-13和THP-1细胞的细胞周期分布。
（c）在NSUN2敲低后，MOLM-13和THP-1细胞中细胞周期相关蛋白的Western blot分析。
（d-e）基因富集图（d）和热图（e）显示铁死亡通路在NSUN2缺失的细胞中显著富集。
（f）MOLM-13细胞的透射电子显微镜（TEM）图像。NSUN2敲低细胞中的黄色箭头突出了铁死亡特征性变化，包括线粒体收缩和嵴解体。
（g-j）MOLM-13（g、i）和THP-1（h、j）细胞在对照或NSUN2敲低条件下，用RSL3或Erastin以梯度浓度处理48小时后通过CTG实验测量细胞活性。
（k-l）对照和NSUN2敲低细胞用250 nM RSL3处理75分钟后Fe2+探针孵育，通过流式细胞术评估。（m-n）对照和NSUN2敲低细胞用250 nM RSL3处理75分钟后通过流式细胞术用BODIPY 581/591 C11染色评估脂质过氧化水平（m）。脂质过氧化水平的定量结果如图（n）。
（3）FSP1表达依赖于NSUN2介导的RNA m5C修饰
NSUN2缺失导致AML细胞中RNA m5C修饰水平显著降低（图3a）。通过RNA-Bis-seq测序技术，研究人员鉴定出NSUN2缺失导致的m5C修饰位点变化，其中FSP1 mRNA的3’UTR区域出现多个m5C修饰位点的低甲基化（图3g）。NSUN2缺失降低了FSP1 mRNA和蛋白水平（图3h、i），而重新表达野生型NSUN2（非催化失活突变体）可以恢复FSP1表达。此外，NSUN2与FSP1 mRNA直接互作（图3j），且这种相互作用依赖于m5C修饰（图3k）。YBX1被鉴定为与FSP1 mRNA相互作用的蛋白（图3l），其敲低也能降低FSP1水平（图3m）。NSUN2和YBX1均能稳定FSP1 mRNA，其半衰期在NSUN2或YBX1缺失时显著缩短（图3n）。荧光素酶报告基因实验表明，NSUN2和YBX1的缺失仅对野生型FSP1-3’UTR报告基因的活性产生影响，而对破坏m5C修饰位点的突变体无影响（图3o、p）。
图3：FSP1的表达依赖于NSUN2介导的RNA m5C修饰。
（a）通过点杂交法分析转染shCtrl、shNSUN2#1或shNSUN2#2的MOLM-13和THP-1细胞中总RNA的m5C水平。以甲基蓝（MB）染色作为装载对照。
（b）shNSUN2与shCtrl MOLM-13细胞中，m5C位点在5’UTR、CDS、3’UTR区域密度分布。
（c）通过Bis-seq鉴定的NSUN2敲低MOLM-13细胞中差异甲基化位点的火山图。低甲基化（蓝色）和高甲基化（红色）位点突出显示（n=3个生物学重复）。
（d）在对照和NSUN2敲低的MOLM-13细胞中，m5C水平在染色体上的平均值。
（e）维恩图显示了低甲基化（Bis-seq）和表达下调（RNA-seq）的基因交集。FSP1为候选基因。
（f）在NSUN2敲低后，FSP1下调的RNA-seq结果（n=3）。
（g）在NSUN2敲低的MOLM-13细胞中，FSP1 mRNA上八个胞嘧啶残基（C1236-C1300）的位点特异性m5C水平，通过Bis-seq定量。
（h-i）NSUN2敲低降低了MOLM-13和THP-1细胞中FSP1 mRNA（h，qPCR）和蛋白（i，Western blot）水平。
（j）使用抗NSUN2抗体的RIP-qPCR显示，与IgG对照相比，FSP1 mRNA显著富集（n=3）。
（k）使用m5C抗体的m5C-RIP-qPCR显示，在NSUN2敲低细胞中，FSP1的富集度降低（n=3）。
（l）使用抗YBX1抗体的RIP-qPCR检测MOLM-13细胞中富集的FSP1（n=3）。
（m）YBX1敲低破坏MOLM-13和THP-1细胞中FSP1蛋白表达。
（n）在转录终止后用5μg/ml放线菌素D进行FSP1 mRNA稳定性实验。NSUN2敲低降低了MOLM-13细胞中FSP1的半衰期。
（o）破坏m5C位点的FSP1-3’UTR突变方案。293T细胞共转染shNSUN2/shYBX1和报告质粒（FSP1-3’UTR-WT或FSP1-3’UTR-Mut）。
（p）荧光素酶实验显示，与shCtrl相比，NSUN2/YBX1敲低抑制了野生型（WT）FSP1-3’UTR的活性（n=3），但对突变构建体没有影响。
（4）FSP1缺失显著抑制AML体内外进展
FSP1在AML患者骨髓样本中显著高表达（图4a），且其高表达与不良预后相关（图4b-d）。在体外实验中，FSP1基因敲除的AML细胞增殖能力下降（图4g、h），增殖细胞比例减少（图4i、j）。在体内实验中，FSP1基因敲除的AML细胞在小鼠模型中形成的白血病负荷减少，生存期延长（图4k-m），骨髓中人CD45阳性白血病细胞比例降低（图4n），组织学检查也显示骨髓中白血病细胞浸润减少（图4o）。
图4：FSP1缺失显著抑制AML体内外进展。
（a）健康供体（n=24）和AML患者（n=303）骨髓细胞中FSP1表达水平的qPCR分析。
（b）TCGA-AML队列中，根据FSP1中位数表达水平分层的AML患者的Kaplan-Meier生存分析。
（c）GSE6891队列中，根据FSP1表达水平分层的AML患者的Kaplan-Meier曲线（FSP1低表达，n=160；FSP1高表达，n=160）。
（d）本研究队列中，根据FSP1表达水平分层的AML患者的Kaplan-Meier曲线（FSP1低表达，n=151；FSP1高表达，n=152）。
（e-f）通过qPCR（e）和Western blotting（f）验证了靶向FSP1（shFSP1#1或shFSP1#2）或对照shRNA（shCtrl）的shRNA转导的MOLM-13和THP-1细胞的敲低效率。
（g-h）通过CTG实验观察FSP1敲低后MOLM-13（g）和THP-1（h）细胞随时间的生长能力。
（i-j）通过EdU实验检测FSP1敲低的MOLM-13（i）和THP-1（j）细胞的增殖能力。
（k）通过尾静脉注射将转导了针对FSP1的shRNA（shFSP1）或对照shRNA（shCtrl）的MOLM-13-luc细胞注入B-NDG小鼠。在第7、14、21、28、35天通过荧光成像监测肿瘤负荷。
（l）第7、14、21天小鼠平均荧光强度的定量分析。
（m）通过log-rank检验确定统计学意义的B-NDG小鼠的Kaplan-Meier生存曲线，这些小鼠通过尾静脉注射了MOLM-13-luc细胞（对照或FSP1敲低）。每组n=6。
（n）通过流式细胞术显示股骨骨髓中hCD45阳性母细胞的比例。
（o）两组的股骨HE染色。
参考文献：
Ye, W., Zhao, Y., Zhou, Y. et al. NSUN2-mediated cytosine-5 methylation of FSP1 protects acute myeloid leukemia cells from ferroptosis. Mol Cancer 24, 201 (2025). Doi:10.1186/s12943-025-02394-8
