CHIP-seq送样要求
CHIP-seq送样要求（版本：2021年11月）
A、染色体免疫共沉淀测序（CHIP-seq）
抗体由客户提供，或者与客户协商后可代客户购买。
【注意事项】抗体应该为ChIP专用的IP抗体
1、细胞样品处理要求
送样前需客户进行交联处理。
（1）贴壁细胞：
a)用PBS缓冲液（pH7.4）新鲜配制浓度为1%的甲醛溶液，37℃水浴锅预热待用；
b)弃除细胞培养液，用PBS洗涤后（去除干净），加入预热的1%新鲜配制的甲醛溶液，对于转录因子或DNA结合蛋白，37℃细胞培养箱孵育10-15min固定；对于组蛋白修饰研究，37℃细胞培养箱孵育5-8min。转录因子等研究要求直接在培养皿固定，组蛋白修饰优先推荐在培养皿直接固定，可接受胰蛋白酶消化细胞悬液后固定，（10cm细胞培养板需要10ml，15cm细胞培养板需要15ml）；
c)弃除甲醛溶液，分别用预冷的1×PBS+BSA（5mg/ml）缓冲液及预冷的1×PBS缓冲液清洗细胞各一次（10cm细胞培养板需要10ml，15cm细胞培养板需要15ml）；
d)在细胞培养板上均匀滴上500ul冰预冷的PBS完全液（PBS+1×PIC蛋白酶抑制剂）；
e)用刮板将细胞从培养板上刮下来，收集至EP管中；
f)2500rpm离心1分钟；
g)移除上清，轻弹管壁使收集的细胞重悬于残余的PBS中；
【注意事项】-80℃冻存，干冰寄送，每个样本细胞量不低于107
（2）悬浮细胞样本处理：
a)用PBS缓冲液（pH7.4）新鲜配制浓度为1%的甲醛溶液，37℃预热待用，每个样品约10ml；
b)将不少于2X107细胞收集到离心管，500g离心5min弃除细胞培养液；用PBS洗涤，离心后（去除干净），加入5-10ml预热的1%新鲜配制的甲醛溶液轻轻重悬细胞，对于转录因子或DNA结合蛋白，37℃细胞培养箱孵育10-15min固定；对于组蛋白修饰研究，37℃细胞培养箱孵育5-10min；
c)弃除甲醛溶液后（可用终浓度125mM的甘氨酸中和），分别用约10ml预冷的1×PBS+BSA（5mg/ml）缓冲液及预冷的1×PBS缓冲液清洗细胞各一次；
d)在细胞沉淀中加入约500ul冰预冷的PBS完全液（PBS+1×PIC，蛋白酶抑制剂），转入1.5ml的离心管，2000rpm离心1分钟；
e)移除上清，轻弹管壁使收集的细胞重悬于残余的PBS中；
【注意事项】-80℃冻存，干冰寄送，每个样本细胞量不低于107
2、动物组织样品处理要求
a)尽快取下组织，去除其他附着组织如脂肪组织等；
b)剪开主血管，用冰冷的PBS 缓冲液（pH7.4）洗去血液；
c)尽量去除组织表面液体后放置到冻存管，液氮速冻后-80℃保存；
【注意事项】整个处理过程中要注意外源物种组织或者细胞污染，处理时间不要太长，最好不要超过1小时，且在冰上操作。
a)样品需求量：每次ChIP 反应起始量为：人或者小鼠的组织：0.6 g 以上；（以上起始量根据小鼠组织实验结果，其他物种根据基因组大小起始量按比例调整）
b)样品必须使用干冰运输，时间尽量不要超过 72 小时，同时请用 Parafilm 膜将管口密封好，以防出现污染。
【注意事项】在运输过程中一定不能出现冻融现象出现，如果发现冻融现象建议重新寄样品。
a)请客户仔细处理样品，尽量避免污染和运输途中出现冻融，如果样品珍贵请客户自行将所送样品进行保留备份。
3、植物组织样品处理要求
a)收集1.5g植物材料在50ml的试管中，在试管中加入40ml 1X PBS和1.08ml甲醛（甲醛最终浓度为1%，且交联过程在冰上操作），然后在50ml试管的盖子上打一个小洞。
b)拧上盖子后放入干燥器中，真空处理10min。小心释放真空，避免搅拌组织，重复2~3次，使组织呈现半透明状，且有下沉的的趋势（如图所示）。
c)加入2 M甘氨酸2.5 ml，最终浓度为0.125 M，真空处理5 min。
d)将50毫升盖子上有孔的试管翻转，倒去PBS、甲醛、甘氨酸混合溶液。
e)加入1x PBS清洗植株两次，再用水清洗植株一次，丢弃洗涤液。
f)用纸巾把它们擦干，然后用锡箔纸包裹后冷冻在液氮中。
g)(A)在交联步骤之前，植物材料漂浮在溶液表面，并被小气泡覆盖;叶的背面和正面的颜色不同。(B)固定后，植株明显浸泡在溶液中，略透明，均匀浸泡在交联溶液中。
【注意事项】冷冻组织可在-80℃下保存数周，寄送过程使用干冰寄送，在运输过程中一定不能出现冻融现象出现，如果发现冻融现象建议重新寄样品。
4、细菌ChIP样本前处理操作
a)将菌种接种到约10ml的LB培养基28℃培养过夜；
b)重新接种次培养，放大培养基至约100ml培养至对数期（OD600大约在0.6）；
c)加入新鲜的37%的甲醛溶液至终浓度为1%，24℃摇床（约90rpm）交联20min，（每100ml培养基加入2.778ml的37%甲醛）；
d)加入新鲜配制的2.5M的甘氨酸，至终浓度为125mM，室温摇床孵育10min，终止交联；
e)6000rpm 4℃离心10min，去上清，收集细胞沉淀；
f)用20ml预冷的TBS（20mM Tris-HCl pH7.5，150mM NaCl）重悬菌体，6000rpm 4℃离心10min，去上清，收集细胞沉淀；
g)将菌体用2ml预冷的TBS缓冲液重悬，转移至1.5ml离心管中，每管1ml，共两管（一管备用），6000rpm 4℃离心10min，去上清（上清尽可能去除干净）
h)-80℃冻存，干冰运输。
5、富集后仅建库
a)IP后Qubit检测富集DNA≥5ng，浓度不低于0.5ng/ul；
b)DNA溶解于EB缓冲液（10mM Tris-HCl，pH 7.5-8.5）；
c)提供IP前染色质打断后的电泳图片，DNA片段分布在100-500bp为宜；
