植物内生菌中可培养的微生物种类十分有限,宏基因组学(metagenomics)是研究植物内生菌的有效手段之一。植物内生菌宏基因组研究通过不依赖于纯培养的宏基因组学(metagenomics)研究方法,构建植物内生菌的宏基因组文库,并从该文库中直接筛选获得生物合成基因簇,进一步鉴定其功能, 对植物内生菌进行定性及定量分析，为植物的微生物起源提供直接的证据。

技术优势：

超深度检测：提取的全宏基因组DNA建立随机小片段文库，避免了目的片段的PCR过程，降低bias，随机测序，获取更丰富的序列信息。

植物组织表面菌处理：通过实验方法去除植物外表面菌株污染，准确测序植物内生菌种类、丰富及互作关系，真实还原构建微生态系统的功能网络。

16S全长检测：植物内生菌提取DNA后，通过16S全长扩增，质控内生菌提取效果。

实验策略：

信息分析：

技术参数：

样本要求：

植物内生菌样本：

①根据植株大小及研究目的确定取样范围，采集植物组织后置于无菌取样袋或50mL离心管中暂时保存，建议每个样采集25g以上，保证分装后每份约10~15g鲜重；

② 6小时内可用冰袋运输至实验室，超过6小时建议液氮或干冰运回实验室，常温需在2小时内完成采集和运输；测序策略：PE150

其他注意事项：

① 最终样本质量以我司的检测结果为准；

② 若样本总量超过要求，可以进行样本保存，反样；项目完成后，将不再保存剩余样品。

研究案例：

病原菌介导植物内生菌群抑病功能的激活

Carrión VJ,et al.Pathogen-induced activation of disease-suppressive functions in the endophytic root microbiome. Science. 2019 Nov 1;366(6465):606-612.

1、背景：

植物微生物组研究已经积累了大量的测序数据和丰富的信息，表明了许多植物根际、叶际、种子和胚层中不同微生物群落的多样性和丰富度。然而迄今为止，很少有研究论证微生物组对特定植物表型（即植物生长、发育和健康）的功能影响。因此，在分子和化学层面上许多植物表型与微生物组结构和功能之间在的因果关系仍然未知。本研究旨在探讨植物内生微生物菌群（植物内生菌）的基因多样性及对真菌感染植株的保护作用。

2、方法：

为了解生活在植物根组织中的植物内生菌的抑病功能，作者对生长在抑病土壤中的甜菜幼苗根内进行宏基因组测序分析；并鉴定与抑病相关的微生物群落和功能组成，以区分哪些生物合成基因簇（BGCs）在感染过程中上调，然后重组内生菌群；最后进行位点定向突变，检测特异性BGCs是否在抑病过程中起着重要作用。

3、结论：

本研究中，植物内生菌的宏基因组学研究和网络推论表明，植物根部的真菌感染在根内Chitinophagaceae和Flavobacteriaceae富集；同时，几丁质酶基因、编码非核糖体肽合成酶（nonribosomal peptide synthetases，NRPSs）和聚酮合成酶（polyketide synthases，PKSs）产生的各种未知生物合成基因簇。在菌株基因组重建后，由Chitinophagaceae和Flavobacteriaceae合成的菌群持续抑制真菌根部疾病。定点诱变表明，黄杆菌中此前未鉴定的NRPS-PKS基因簇对内生菌群抑病至关重要。研究结果表明，内生根微生物组（植物内生菌）具有许多尚不为人所知的功能性状，可以共同保护植物内外。

图：内生菌群落生物合成基因簇的多样性和分布