全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持，能广泛应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究中，也是各物种甲基化图谱研究的首选方法。

 

全基因组甲基化测序技术通过T4-DNA连接酶，在超声波打断基因组DNA片段的两端连接接头序列，连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T。

 

应用方向：

WGBS广泛用于各种物种，要求全基因组扫描（不错过关键位点）

Ø  全基因组甲基化图谱课题

Ø  标志物筛选课题

Ø  小规模研究课题

 

技术优势：

Ø  应用范围广：适用于所有参考基因组已知物种的甲基化研究；

Ø  全基因组覆盖：最大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱；

Ø  单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态；

 

技术路线：

实验策略：

分析内容：

WGBS	分析内容
标准分析	测序数据质量评估： 1、转化效率评估； 2、原始下机数据质控； 3、比对质量评估； 4、测序深度和覆盖度评估
	全基因组甲基化水平分析： 1、全基因组甲基化水平概览； 2、各样本全基因组甲基化图谱展示； 3、甲基化平均水平统计； 4、全基因组甲基化的分布； 5、各样本甲基化水平分布比较； 6、各基因元件的甲基化水平特征； 7、基于全基因组甲基化图谱的分层聚类； 8、基于全基因组甲基化图谱的主成分分析；
	差异甲基化区域（DMR）的鉴定及统计： 1、差异甲基化区域（DMR）的鉴定； 2、DMR的基本统计； 3、DMR所修饰基因的注释； 4、DMR修饰基因的统计； 5、DMR在染色体上的分布； 6、DMR在基因元件上的分布； 7、DMR所修饰基因的功能富集分析
注：个性化分析、多组学关联分析请联系对接销售或技术支持

送样要求：

送样要求	项目周期
1、样本类型：细胞，组织或总DNA等 2、样品DNA需求量：不同样本需求不同，人类样本≥1μg；样品DNA纯度：OD260/280=1.8~2.0； 3、样品DNA完整性：DNA无明显降解，需提供凝胶电泳检测胶图； 4、其它注意事项：①最终DNA量以我们的检测结果为准；②若DNA总量超过样品要求，可要求保存样品；	35-40个工作日

技术指标：

技术参数	WGBS	cfDNA-RBS	RRBS系列
原理	全基因组范围重亚硫酸盐测序	酶切富集+重亚硫酸盐测序	单双酶切富集+重亚硫酸盐测序
样本要求	1μg	1ng	100ng
测序数据量	30X	20G	10G
CG位点覆盖	全基因组CG覆盖	10-20M	6-10M
覆盖深度	平均30X	50-100 X	50-100 X
区域元件覆盖	全覆盖	CpG岛、启动子、增强子、CTCF结合位点等	CpG岛、启动子等
技术定位	甲基化全基因组单碱基检测	金标准，特别适用于cfDNA样本的Biomark筛选和机制研究	金标准，Biomark筛选和机制研究

不同DNA甲基化检测技术特点：

1、WGBS和RRBS用于基因组范围内研究探索，并筛选目标基因（候选DNA甲基化标记物）；

2、Target-BS（TBS）用于后续目标基因的甲基化验证

经典案例

医学方向：

Whole-Genome Bisulfite Sequencing of Two Distinct Interconvertible DNA Methylomes of Mouse Embryonic Stem Cells. 两种状态的小鼠胚胎干细胞的甲基化组学研究

背景

小鼠胚胎干细胞一般生长在含有血清的基质中，被称作血清干细胞(serum ESCs)；加两种激酶抑制因子使胚胎干细胞在无血清的情况下更能保持多能性的基态，这种干细胞称为2i干细胞(2i ESCs)；这两种状态的胚胎干细胞可以互相转化。以前这方面的甲基化研究大多基于质谱，覆盖度和研究结果有限，尚缺乏2i胚胎干细胞的甲基化组学研究。

方法

利用全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS），对这两种可互相转换的小鼠胚胎干细胞进行甲基化组学研究

结论

全面准确的检测了两种小鼠胚胎干细胞的DNA甲基化修饰并进行了系统的比较；同serum ESCs相比，雄性2iESCs全局低甲基化；在血清中，雌性ESCs跟雄性2i ESCs类似呈现全局低甲基化，而在2i ESCs状态下，甲基化水平会进一步降低。

不同状态下小鼠胚胎干细胞的甲基化修饰比较

农学方向：

Global increase in DNA methylation during orange fruit development and ripening（甜橙果实发育和成熟过程中全基因组DNA甲基化增加）

背景

DNA甲基化是参与许多生物过程的重要表观遗传标记。已有研究表明，番茄在成熟过程中全基因组DNA甲基化会显著降低，但其他水果的成熟是否与全基因组DNA去甲基化有关还尚不清楚。

方法

纽荷尔甜橙(Citrus Sinensis Osbeck)果实，采集了开花后90、120、150、180和210d的五个不同发育阶段的果实。采集橙果皮，并保存在-80°C，用于DNA和RNA的提取。

 结果

作者鉴定了甜橙果实的单碱基分辨DNA甲基化情况。与未成熟的甜橙果实相比，成熟的甜橙果实在3万多个基因组区域获得了DNA甲基化，在大约1000个基因组区域失去DNA甲基化，这表明在甜橙果实成熟过程中全基因组DNA甲基化显著增加。DNA甲基化的增加与DNA去甲基酶基因表达的降低有关。DNA甲基化抑制剂的应用干扰了甜橙果实的成熟，这表明DNA高甲基化是甜橙果实能够正常成熟的关键。作者发现，成熟相关的DNA高甲基化与数百个基因(如光合作用基因)的抑制和数百个基因(包括与脱落酸反应有关的基因)的激活有关。作者的结果表明DNA甲基化在甜橙果实成熟过程中起着重要作用。

甜橙果实发育和成熟期间全基因组DNA甲基化增加

参考文献：

1、Ehsan Habibi, et al. Whole-Genome Bisulfite Sequencing of Two Distinct Interconvertible DNA Methylomes of Mouse Embryonic Stem Cells. Cell Stem Cell (2013), 13(3), 360-369.

2、Huang H, et al. Global increase in DNA methylation during orange fruit development and ripening. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019 Jan 22;116(4):1430-1436.